Yumurta toplama işleminin ardından kadından alınan yumurta ve erkekten alınan spermler laboratuvar ortamında döllenir. Bu embriyo transferi gerçekleştirilmeden önce ki son adımdır. 
Yumurta toplama (OPU) işlemi sırasında emilerek alınan follikül içeriği hemen laboratuvara gönderilir. Özel bir mikroskopla incelenen bu sıvının içinde bulunan yumurtalar kültür sıvısının içine konarak inkübatör denilen aygıta kaldırılır. İnkübatör, sıcaklığı 37 ^oC, karbondioksit oranını da %5 - 6, oksijen oranını %5 düzeyinde sabit tutar. Olgun yumurta hücreleri 4 - 6 saat sonra döllenme için hazır hale gelir. Uyarılma sonrası çapı 18 - 22 mm arasında olan folliküllerin yaklaşık %80'inden döllenmeye uygun olgun yumurta elde edilebilir.

Kadından yumurtaların (oositlerin) toplandığı esnada erkek de sperm verir. Sperm alınması içn en ideal yöntem mastürbasyondur. Menisinde canlı sperm bulunamayan kişilerde ise cerrahi olarak sperm aranır. Elde edilen meni özel bir kap içine alınır ve sıvılaşması beklenir. Sıvılaşan meni, sperm sayısı, hareketliliği ve şekli yönünden incelenir.
Tüp bebek planlanan hastalarda en önemli kriter hareketli sperm sayısıdır. İncelenen sperm döllenme için hazırlanır. Sperm hazırlaması iki nedenden dolayı önemli. Bunlardan birincisi menide bulunan yabancı proteinleri temizlemek, ikincisiyse  bazı reaksiyonları tetikleyerek spermin hiperaktif olmasını sağlamak.
Yumurta kültürü ve sperm hazırlanması tamamlandıktan sonra döllenme işlemine geçilir. İki türlü dölleme yöntemi vardır.

1. Spermlerle yumurtalar biraraya bırakılırlar. Her bir yumurta hücresi için 20.000 sperm kullanılır. Sperm parametrelerinin bozuk olduğu durumlarda bu sayı arttırılabilir. Erkek faktörü varlığında veya nedeni açıklanamamış infertilite olgularında bu yol tercih edilmez.
2. Her bir yumurta içine bir tane sperm mikroskop altında, özel yöntemlerle yerleştirilir.Buna intrastoplazmik sperm enjeksiyonu veyahut kısaca mikroenjeksiyon denilir. Sperm sayısının çok az olduğu, sperm işlevlerinin bozuk olduğu veya açıklanamayan infertilite durumlarında mikroenjeksiyon (ICSI) tercih edilmelidir.

 İşlemden 16 - 18 saat sonra döllenme olup olmadığı kontrol edilir. Döllenmiş yumurtada tek olan çekirdek sayısı ikiye çıkmıştır.

Döllenmiş yumurtalar tekrar kültür ortamına konur ve ileri aşamalara ulaşmaları beklenir. Uygun aşamaya gelindiğinde embriyolardan kaliteli olanlarından belirli bir sayıda alınarak kadının rahmi içine transfer edilir.